Bioactive Materials | TOMID王佳力课题组和张超课题组在二价金属离子介导神经系统活性和调控干细胞代谢途径促骨再生方面发表论文

近日，中山大学王佳力课题组和张超课题组通过间接途径和直接途径探索二价金属离子（如钙、镁、锌等）促骨生成机制。相关工作以“Divalent metal ions enhance bone regeneration through modulation of nervous systems and metabolic pathways”为题发表于著名期刊Bioactive Materials（生物材料领域排名第一）。

间接途径方面，二价金属离子激活感觉和副交感神经，同时抑制交感神经，继而调控影响骨形成神经递质的释放；直接途径方面，二价金属离子能上调成骨分化启动后成骨细胞活性，并伴随葡糖糖代谢模式从氧化磷酸化转向有氧糖酵解（机制图如图1）。

图1 二价金属离子在骨再生修复中的潜在机制示意图。在间接途径中，二价金属离子促进了CGRP和Ach等促成骨神经递质的产生，且抑制了对骨再生有负面影响的NE合成。在直接途径中，二价金属离子上调BMSCs 中Tgf-β1和Integrin-β1的基因表达水平。此外，由于神经递质启动了BMSCs的成骨分化，二价金属离子对分化后的BMSC的有氧糖酵解发挥积极作用，从而提高了其成骨分化潜能。重要的是，不同的二价金属离子的组合整合了不同的生物功能，融合后有着如同中国动画中的“金刚葫芦娃”之效，更有效地促进骨再生。

  一、双金属离子组对Mg ²⁺、 Ca ²⁺或 Zn ²⁺的耐受限度高于单金属离子组

如图2和3所示，确定了不同浓度的单离子和组合双离子的细胞毒性。Ca²⁺，Mg²⁺ 和Zn²⁺单金属离子最大耐受浓度分别为 11.8 mM，20.8 mM 和 20 µM 。由于其他离子的存在可能会影响细胞对单一离子的耐受限度，因此也探究了双离子组合对 BMSC 细胞毒性的影响，结果表明双金属离子组对各金属离子的耐受限度均有所提高。

图2 不同浓度Ca ²⁺、Mg ²⁺和Zn ²⁺对BMSCs细胞毒性的影响。

图 3 Ca-x Mg、Ca-x Zn、Mg-x Ca、Mg-x Zn、Zn-x Ca 和 Zn-x Mg 组成的双离子组合对 BMSC 细胞毒性的影响。

  二、二价金属离子通过促进Integrin-β1和TGF-β1的表达水平促进BSMCs的粘附和迁移

基于RNA测序预测二价金属离子对BMSC可能的直接调控途径，结果表明 Integrin途径和 TGF-β 信号通路参与其中（图4）。与其他二价金属离子不同，由 Mg 和 Ca 离子组成的二价金属离子通过调节Integrin和 TGF-β 相关信号通路调控 BMSCs功能，该结论在PCR 结果也得到进一步验证，表明 Mg 和 Ca 离子能促进 BMSCs 的粘附和迁移 。

图 4 有/无二价金属离子处理的 BMSC 的 RNA-seq 分析及相关基因水平的表达。

  三、二价金属离子可能通过增强成骨分化启动后BMSCs的有氧糖酵解行为来上调其成骨分化功能

在无成骨诱导液下培养中，二价金属离子或其组合处理不影响 RUNX2 的表达水平（图5）。值得注意的是，与葡萄糖代谢相关的几种途径如 HIF-1α和p-mTOR/mTOR等蛋白的表达水平也并无显著影响。同样的，二价金属离子处理未能显著影响葡萄糖、乳酸和细胞内 ATP 的浓度。CGRP 处理显著上调了无成骨诱导液培养下的 BMSC 的 RUNX2 和 SP7 的基因和蛋白质表达水平，表明 CGRP 可以启动 BMSC 的成骨分化。值得关注的是，在成骨诱导液共同刺激下，二价金属离子能显著上调不同分化阶段BMSC的成骨分化潜能（图6），表明CGRP可为二价金属离子发挥促成骨效应奠定基础。与此同时，经二价金属离子刺激后，培养基中葡萄糖和乳酸浓度分别呈显著下降和上升，并伴随胞内ATP的显著降低和HIF-1α以及p-mTOR/mTOR显著增加（图7）。此外，二价金属离子显著增强了成骨分化后 3 天和 7 天 BMSCs 中 2-NBDG 的荧光强度，进一步证实了 BMSCs 的葡萄糖摄取有所增强。同时，二价金属离子显著降低了线粒体复合物 I 的活性（图 8），这意味着 BMSCs 中的线粒体呼吸作用受损。

图 5 二价金属离子和 CGRP 对未分化 BMSC 的成骨和有氧糖酵解的影响。

图6 二价金属离子对不同分化阶段的BMSCs成骨作用及有氧糖酵解相关蛋白表达水平的影响。

图7 二价金属离子对不同分化阶段的 BMSC 有氧糖酵解的影响。

图 8 二价金属离子对分化后的 BMSC 中葡萄糖摄取和线粒体呼吸的影响。

  四、二价金属离子促进骨缺损模型中的骨再生和H型血管形成

基于CT分析，如骨体积分数（BV/TV）、骨小梁数量（Tb. N）、骨矿物质密度（BMD）、骨小梁厚度（Tb. Th）和骨小梁分离（Tb. Sp）等骨结构参数，表明二价金属离子显著促进大鼠股骨骨缺损区域的新骨形成（图9）。值得注意的是，CaMg离子组合在促进骨再生方面表现出最佳的性能。正如组织学评估所示（图10），二价金属离子显著改善了大鼠骨缺损的愈合质量（包括骨形成、皮质完整性和骨重塑），并伴随骨缺损H 型血管（CD31hi EMCNhi ）生成的显著增加（图11）。

图 9 大鼠股骨缺损处新生骨组织的 Micro-CT 分析。

图 10 代表性组织学图像和组织学评分的定量分析。

图 11 二价金属离子显著促进大鼠骨缺损中H 型血管的形成。

  五、二价金属离子上调感觉神经和副交感神经活性并下调交感神经活性

进一步地，基于免疫荧光染色发现二价金属离子显著增加了大鼠骨缺损中 CGRP 阳性区域（感觉神经）和胆碱乙酰转移酶（ChAT）阳性区域（副交感神经），并相应显著减少了酪氨酸羟化酶（TH）阳性区域（交感神经）的相对荧光强度（图12和13），提示二价金属离子可能通过调控感觉-交感-副交感神经环路介导骨再生。

图 12 二价金属离子显著上调骨缺损中的 CGRP 阳性区域。

图 13二价金属离子显著上调骨缺损中的 ChAT 阳性区域，并下调TH阳性区域。

综上所述，二价金属离子通过间接和直接两个途径影响骨再生。间接途径方面，感觉-交感-副交感神经系统是二价金属离子发挥促骨生成效应的关键通路；直接途径方面，葡萄糖代谢模式的转变或是二价金属离子上调MSCs成骨分化功能的原因之一。该项工作可为后续骨科生物活性材料或器械的研发提供理论依据和证据支持。

中山大学博士生罗颖、大连大学附属中山医院刘保一主任以及中山大学硕士邱雅诗为论文共同第一作者，中山大学王佳力副教授为论文最后通讯作者，中山大学张超教授为论文通讯作者。本研究得到了国家自然科学基金（项目编号：32271381、32471378、81971760），深圳市科技创新委员会（项目编号：JCYJ20220530145601004），广东省自然科学基金（项目编号：2024A1515010311），大连市医学科学研究项目（项目编号：2111038），国家重点研发计划项目（项目编号：2020JH2/10300093），辽宁省教育厅重点研究项目（项目编号：LJKZZ20220148）和辽宁省卫健委“兴辽市卓越计划”医学硕士项目（项目编号：YXMJ-QN-21)的资助。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2025.01.034

供稿：罗颖

终审：王佳力