科研动态 / 戴宗教授团队开发高灵敏CRISPR/Pepper-tDeg成像系统：成功实现单条sgRNA标记非重复基因座

活细胞非重复基因座成像

非重复序列占据了了人类基因组的大多数，其活细胞成像分析有助于充分了解染色体结构和动力学，包括染色体易位、缺失、复制以及与RNA和蛋白质的相互作用。CRISPR系统被广泛应用于活细胞内重复基因座的时空成像，但其有限的信噪比难以成像非重复基因座。为提高信噪比，人们常通过将多个RNA适配体插入sgRNA或采用串联荧光蛋白进行信号扩增，但多个元件的插入会影响sgRNA稳定性并严重降低sgRNA的表达量，且过多的荧光蛋白融合容易在细菌内发生重组造成质粒构建困难。当前非重复序列成像方法仍然需要同时递送多个不同的sgRNAs来实现高信噪比，但多个sgRNAs容易导致高脱靶性。

近日，戴宗教授团队提出了一种高信噪比的基因座成像系统——CRISPR/Pepper-tDeg，在CRISPR相关sgRNA插入Pepper适配体，其可结合降解肽（tDeg）融合荧光蛋白。理论上产生的高SNR来源于：（1）未结合靶标的sgRNA和FP-tDeg快速降解介导双重信号去噪；（2）通过在sgRNA茎环中插入2个Pepper和tDeg融合串联荧光蛋白进行双重信号放大。当CRISPR与目标DNA结合时，触发sgRNA和荧光蛋白的级联稳定，分别保护它们免受RNase和蛋白酶降解，从而在目标位置“点亮”荧光信号。与传统方法CRISPR/MS2-MCP使用“常亮”的荧光蛋白标记重复端粒相比，本系统通过目标稳定sgRNA并同时“点亮”荧光蛋白的策略将信噪比提高了5倍。该方法与传统CRISPR/MS2-MCP共标记的端粒具有相似的运动轨迹，均呈现受限运动。随后，该系统被用于测量Hela、U2OS和HEK293T三种细胞的端粒长度，还估计了细胞群体中端粒长度的异质性。进一步，我们设计CRISPR/Pepper-tDeg标记着丝粒，CRISPR/MS2-MCP标记端粒，二者显示出不同的运动轨迹。我们观察到着丝粒的D_micro较小，这表明其运动比端粒慢。这些结果证明CRISPR/Pepper-tDeg能够对活细胞内不同的重复基因座进行双色标记，且与传统方法具有很高的兼容性。

进一步，戴宗教授团队采用分裂的GFP系统实现CRISPR/Pepper-tDeg的信号放大。通过GFP11-tDeg质粒表达tDeg融合串联GFP11和GFP1-10，两者可重组形成荧光GFP。相比之前，GFP11-tDeg的SNR提高了3.4倍，标记的平均端粒数增加了1.25倍。基于分裂GFP信号放大的CRISPR/Pepper-tDeg系统由于其高信噪比，具有与FISH相媲美的端粒标记效率，并实现了单个sgRNA标记非重复MUC4和IL-1B，与FISH具有良好的共定位。这种基于极简设计的CRISPR/Pepper-tDeg成像系统易于操作和推广，可以量化活细胞中重复甚至非重复的基因座，在端粒长度缺陷相关疾病的诊断等常规临床诊断中显示出很好的实用性，展示了该基因组成像系统在生物学研究、临床诊断和治疗评估中的巨大应用潜力。

相关研究成果以“CRISPR/Pepper-tDeg: A Live Imaging System Enables Non-Repetitive Genomic Locus Analysis with One Single-Guide RNA”发表于相关领域高水平期刊Advanced Science, 2024(https://doi.org/10.1002/advs.202402534)。我院博士生陈蒙为本论文第一作者，我院戴宗教授为本论文的通讯作者。